Da “La Voce dei Senza Voce” n. 105, → sfoglia il numero online.
Supervisionata dalla dottoressa Susanna Penco (a sinistra, sopra), la ricerca con metodi alternativi/sostitutivi alla sperimentazione animale ha dato i suoi frutti.
Ha dichiarato il professore Bruno Fedi (consulente scientifico LEAL): “La ricerca riguarda l’isolamento e la differenziazione di cellule adipose umane adulte in cellule embrionali neurali. La fluorescenza dimostra la presenza di una sostanza tipica delle cellule neurali. Dunque, ha avuto successo. Congratulazioni ai ricercatori: hanno dimostrato che la cosa è possibile”.
Progetto dottoressa Sara Tirendi (a sinistra, sotto), LARF-DIMES, Università di Genova. Differenziamento neurogenico di cellule umane staminali adulte derivate da tessuto adiposo, quale modello sostitutivo alla sperimentazione animale, per lo studio della neurotossicità di composti chimici, in accordo alla direttiva 86/609/CEE.
Coperto da una borsa di studio finanziata dalla LEAL, il progetto è focalizzato sul “replacement” (la completa sostituzione dell’animale) elaborando un modello di predizione del rischio della salute umana in seguito all’esposizione di sostanze chimiche (farmaci, inquinanti) valutata su neuroni umani, derivati dal differenziamento di cellule umane staminali adulte, isolate da tessuto adiposo di scarto da interventi chirurgici (Adipose-Derived Stem Cells, hADSC) previo consenso informato.
Nel periodo coperto dall’ultima borsa erogata da LEAL (dall’1 giugno al 31 ottobre 2016) sono stati processati 2 lotti di tessuto adiposo, rispettivamente da lipofilling, LP, (1 a 20 ml., ciascuno) e da capsule renali, CR, (materiale di scarto di procedure di trapianto renale). Da ogni campione, si è proceduto all’isolamento e amplificazione delle hADSC (5-6 settimane) in terreno di coltura addizionato con lisato piastrinico umano commerciale (LysetTM), quale sostituto del siero fetale bovino (replacement).
Le hADSC sono state congelate in azoto liquido, per poter avere “scorte” di cellule a diversi passaggi per ogni lotto. Per verificare se le hADSC esprimessero caratteri di staminalità, dall’isolamento ai successivi 8 passaggi di amplificazione (P0-P8) si è effettuata l’analisi dell’espressione di alcuni geni marcatori di staminalità. I geni maggiormente espressi sono risultati NANOG e OCT4 confermando la staminalità dei campioni, dal passaggio 0 a quello 8 di amplificazione delle hADSC.
Le hADSC LP hanno evidenziato livelli di amplificazione marcatamente superiori dei geni in esame rispetto a quelle da CR, probabilmente per il fatto che queste ultime, provenendo da procedure in campo aperto da sala operatoria, non erano risultate esenti da contaminazioni e la conservazione del tessuto non è stata ottimale per l’isolamento delle ADSC. Mentre le hADSC LP sono ottenute con procedure sterili (siringa). 2 lotti di hADSC LP (P2 e P5) sono stati utilizzati per la successiva fase di induzione del differenziamento neurogenico, secondo un protocollo interno del LARF che prevede una fase di pre-differenziamento e una di differenziamento, ciascuna di 7 giorni. In ognuna delle 2 fasi, le hADSC sono state coltivate in presenza di terreni di crescita addizionati con specifici fattori di crescita. In parallelo, si è allestita una coltura di hADSCs in terreno standard di crescita, come controllo negativo. Durante la fase di pre-differenziamento, le hADSC hanno mostrato una diversa morfologia, distaccandosi dal supporto di coltura e assumendo l’aspetto di sfere (neurosfere). Durante la successiva fase di differenziamento, le cellule hanno di nuovo aderito al supporto di coltura evidenziando prolungamenti cellulari sottili, simili ai neuriti, in accordo con quanto descritto nel protocollo seguito. Al termine della procedura di differenziamento, le hADCs hanno dimostrato di aver acquisito un fenotipo simile a quello neurale. Infatti, l’analisi in immunofluorescenza ha evidenziato un segnale positivo per Nestina (marcatore neurale precoce) e per GFAP (marcatore astrocitario). Altri marker di differenziamento associati a uno stadio più avanzato, hanno dato per ora segnali ancora deboli.
Alla luce di questi primi risultati, si è proceduto a verificare se questo modello possa essere utile per uno screening di neurotossicità, esponendo le cellule ad alcuni composti neurotossici e non. Eseguite le analisi relative alla tossicità e alla produzione di energia, i risultati preliminari ottenuti sono promettenti.
Il progetto potrà proseguire con queste finalità:
• prolungamento del tempo di esposizione al terreno di differenziamento per consentire alle cellule di esprimere meglio altri markers tardivi di fenotipo neurale;
• allestimento di batterie di test idonei a valutare il potenziale neurotossico attraverso l’analisi della vitalità, competenze metaboliche, bioenergetica, stress ossidativo, potenziale elettrofisiologico, ecc., parallelamente ad analisi in immunofluorescenza per verificare cambiamenti morfologici delle cellule per effetto dei composti testati (inquinanti, farmaci ecc.).
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