Aggiornamenti sui Metodi di Ricerca Sostitutivi Human Based

Articolo a firma di Mirta Baiamonte, referente scientifico LEAL, estratto dall’ultimo numero della nostra rivista “La Voce dei Senza Voce” n. 116 inverno 2019 con i contributi di: Gian Marco Prampolini, Mirta Baiamonte, Francesca Di Biase, Piero M. Bianchi, Giustina De Rosa, Giusi Terrazzino, Stefania Sbarra, Domenico Marrulli, Elvira Giancaterino, Silvia Premoli. Buona lettura.
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Mirta Baiamonte, PhD
Referente scientifico LEAL
Presidente Penco Bioscienze
Presidente IVF Mediterranean Center
Vicepresidente Limav Italia

Dopo anni di assoluto fallimento di metodi di ricerca basati sulla sperimentazione animale/vivisezione, incentrati ad indossare un vestito “risolutivo”per le patologie che ad oggi affliggono la specie animale “uomo”, è importante evidenziare quali siano alcuni dei metodi di ricerca Human Based considerati dal mondo scientifico H.B.R.S. Human Based Research Science, il futuro già attuale dello studio serio nell’ambito della medicina umana, della biologia umana e della genetica umana.
Tipologia metodi sostitutivi basati su ricerca human based
Le metodologie presenti ad oggi, in aggiunta ad esempio, ad organi on chip, stampa organi in 3D, godono di molti protocolli di ricerca human based. Di seguito la descrizione di alcuni di essi.
1) Realizzazione di monostrati (monolayer) di cellule di vari tessuti umani che vengono prelevate, centrifugate, isolate e sottoposte a sistemi di adesione su superfici predisposte (plastiche non tossiche come pareti di fiasche da 50 ml della Falcon o della Nunc) dove mediante terreni di coltura vengono nutrite quotidianamente, poste in Incubatori per colture cellulari con temperatura tarata a 37 gradi centigradi, CO2 al 5-6%, in condizioni di assoluta sterilità, gestite esclusivamente da biologi, biotecnologi o embriologi specializzati sul campo. La loro capacità riproduttiva varia da tessuto a tessuto, a seconda del distretto anatomico di prelievo, in termini di velocità di riproduzione (clonazione di se stesse) ed in termini di scelta di terreni di coltura come componente nutritiva. Questi sistemi consentono di studiare il comportamento fisiologico dei tessuti presi in esame e comprenderne bene le variazioni funzionali che divengono patologiche.
2) Procedure di biopsia di tessuti riproduttivi per tecniche di cryoconservazione in azoto liquido a -196 gradi centigradi, al fine di preservare la stabilità dell’architettura tissutale e potere, dopo opportuna procedura di scongelamento, studiarne le funzioni riproduttive fisiologiche e di eventuale reinnesto in sede anatomica per comprenderne le funzioni organiche in forma basale o in sede patologica, studiandone in vitro tutti i principi attivi come radicali liberi, causa di stress ossidativo, tossicità, invecchiamento del tessuto e produzione conseguenziale di essudati. Tali aspetti citati costituiscono la base di cause di alterazione funzionale del tessuto interessato dal danno, che all’interno dell’organo stanno alla base del cattivo funzionamento dello stesso, provocando le diverse patologie oggetto di studio nei diversi progetti di ricerca.
3) Tecniche di reinnesto di tessuto ovarico in sede non anatomica, per comprenderne la funzionalità, essendo un tessuto in grado di riprendere le proprie funzioni anche fuori dalla cavità del Douglas (piccola pelvi), cioè sul deltoide, sul muscolo della gamba o sul muscolo dell’addome. Studiarne il comportamento in vivo dopo reinnesto con induzione follicolare farmacologica in sede non anatomica e recupero degli ovociti per valutarne la possibilità nell’essere fecondati in vitro con tecniche di procreazione medicalmente assistita in donne infertili, studiando alla base il funzionamento del tessuto ovarico in presenza di patologie come la Pcos (Sindrome da Policistosi Ovarica), l’Endometriosi. La ricerca su gameti e tessuti umani sostituisce da sempre la sperimentazione animale su embrioni ovini e murini. La ricerca su embrioni umani è vietata in Italia dalla Legge 40/2004.

4) protocolli basati sul lavoro di equipe tra embriologi e ingegneri biomedici, o tra biologi biomolecolari e ingegneri biomedici per mantenere in vita in vitro biopsie di tessuti umani su cui sia stato riprodotto il sistema circolatorio con sangue sintetico ed il sistema nervoso mediante impulsi elettrici, umano-mimetici. Questi sono Sistemi di studio in vitro per la funzione dei tessuti malati confrontati con tessuti sani.
5) Sistemi di co-colture di monolayer di cellule della granulosa provenienti da tube di pazienti infertili su cui vengono posti a sviluppare zigoti umani (ovociti fecondati alle 24 h) per velocizzare ed implementare la qualità di clivaggio embrionario sino allo stadio di blastocisti, ultimo stadio di sviluppo dell’embrione umano in vivo e in vitro, competente per attivare una gravidanza mediante impianto su endometrio umano.
6) Sistemi di co-coltura di cellule endometriali umane su cui studiare i meccanismi di scambio metabolico tra blastocisti ed endometrio immediatamente prima dell’impianto per comprenderne i meccanismi quali abortività su base immunologica o fallimento di impianti ripetuti dopo (n) volte di embryo transfer effettuati senza esito di gravidanza.
7) Sistemi di coltura di cellule staminali mesenchimali (Mesenchimal Stem Cells – MSC) da sangue cordonale, estratte ed isolate tramite centrifugazione per suddividere le cellule vive dalle cellule già in apoptosi (morte cellulare programmata) o in necrosi da fattori esterni, per potere clonarne la popolazione e cryoconservarla in aliquote allo scopo di effettuare studi sulla capacità di riproduzione di tessuti umani differenti per tipologia per applicazioni riparative su traumi versus ricerca per ottimizzare gli effetti clinici risolutivi sull’uomo. Le Mesenchimal Stem Cells sono cellule derivanti in fase embrionale dal mesoderma, uno dei tre foglietti embrionali, e sono studiate oggi in seno alle tecniche di riproduzione dei tessuti umani in laboratorio all’interno di Bio Banche, strutture laboratoristiche altamente sofisticate per sistemi di assoluta sterilità, per sistemi di aerazione sterile e di filtri Hepa particolarmente dedicati che garantiscono la purezza dell’aria, vedi ad esempio il Coda Tower, strumento in supplemento nei laboratori di embriologia umana e nelle Bio Banche, per scongiurare qualsiasi tipo di contaminazione che porterebbe al fallimento delle procedura e a sistemi di contaminazione gravi, difficilmente debellabili in breve tempo. Nelle Bio Banche i ricercatori sono altamente specializzati in ricerca human based ed il livello di tecnologia è elevatissimo sia in termini di strumentazione sia in termini di impiantistica e strumentazione. Le MSC di origine umana oggi sono studiate in modo molto preciso perché è stato dimostrato essere in possesso di “plasticità”: dopo che si è venuta a creare una lesione presso un distretto anatomico, le cellule sane di quel tessuto danneggiato hanno il compito di richiamare tramite il sistema linfatico cellule staminali da distretti diversi anche anatomicamente molto lontani. Tali cellule richiamate hanno la capacità di trasformarsi in cellule di quel tessuto, sede di danno e richiamo, grazie al condizionamento da parte di mediatori chimici trasmessi mediante le membrane cellulari dalle cellule sane poste attorno alla lesione alle “nuove arrivate” originariamente costituenti di un’altra tipologia di tessuto umano. È ormai dimostrato che la cellula staminale non ha mai definitivamente subito modificazioni irreversibili, che non la possano mettere nelle condizioni di potere modificare il proprio adattamento ad un contesto architettonico tissutale diverso da quello suo di origine.

8) Microbioma umano: insieme della popolazione di miceti (funghi), virus e batteri che vivono in simbiosi e quindi fisiologicamente con il corpo umano. Presenti in diversi distretti anatomici: colon tutto, retto, vagina, pelle, parete gastrica, bocca, gola, cervello. La loro soglia fisiologica, in termini di titolo di popolazione basale (che varia da ceppo a ceppo), comporta lo stato di salute del nostro corpo, garantendo anche mediante produzione di interleuchine un sistema immunitario sano. Studi su microbioma umano di pazienti affetti da diverse patologie, infertilità inclusa, stanno ampiamente dimostrando la forte ed esclusiva a volte dipendenza dall’asset del microbioma, inteso come variazione dalla condizione fisiologica. Ciò significa che la variazione in eccesso o in difetto della popolazione fisiologica come titolo, comporta la comparsa nell’uomo di molte patologie oggi: infertilità, tutte le donne infertili hanno un microbioma alterato in sede vaginale ed intestinale; molti uomini infertili presentano alterazioni della popolazione di Escherichia Coli nel retto, che per via linfatica transita nella prostata, causando prostatiti croniche, causa di forti e costanti oligoastenozoospermie (campioni seminali alterati nella quantità e nella motilità degli spermatozoi che vengono prodotti ed immessi nell’eiaculato). Coliti da stress con lesioni delle pareti interne del colon trasverso provocando enterorragie croniche non curabili spesso con antibiotici, che invece a loro volta provocano antibiotico resistenza e quindi permanenza della patologia perché la popolazione batterica in eccesso non viene debellata, ma piuttosto portato a riprodursi con maggiore velocità. Morbo di Crohn Alzheimer Parkinson K (carcinoma) del colon retto.
Sul microbioma umano ormai da alcuni anni si trovano specifici collegamenti tra il suo stato fisiologico o alterato e molte patologie umane, come quelle sopracitate. In tal senso la ricerca human based sta puntando i suoi riflettori in modo netto e deciso. Si inizia a parlare di trapianto di microbioma umano tra viventi. Molti studi sull’uomo sono adesso volti anche in seno alla nutrizione e al consumo errato di carne animale, bombardata letteralmente negli allevamenti intensivi da estrogeni ed antibiotici, cause di antibiotico-resistenza, alterazione di assetti endocrini sin dai primi medi di vita, spesso, motivo negli anni successivi di patologie concrete a carico del sistema neuro endocrino. Gli studi umani in questo ambito sono oggi estremamente importanti ed in fieri. A partire dal latte materno dopo il parto, a partire dagli omogeneizzati, a partire dal consumo di latti artificiali, il microbioma del bambino appena nato viene già totalmente alterato nella sua natura fisiologica, causando negli anni, come effetto “collaterale” diretto, l’alterazione del titolo fisiologico delle popolazioni menzionate, provocando la comparsa di patologie anche in età puberale, quando l’assetto neuro endocrino inizia a svilupparsi in modo definitivo, ed è già inconsapevolmente compromesso da abitudini di vita (cibo e abuso di farmaci).
Studi di ricerca human based hanno iniziato a dimostrare che l’elevato numero di tagli cesarei al momento del parto, a volte scelti per praticità organizzativa e non per motivi di “salva vita” del nascituro, alterano il microbioma del bambino che, non transitando dalla vagina della madre, viene privato dell’assunzione del giusto microbioma vaginale della madre. Tutti i metodi citati quali esempi di ricerca e applicazione clinica derivanti, su specie umana costituiscono serie sostituzioni a metodi arcaici e fallimentari quale la sperimentazione animale. Tutti i metodi elencati sono oggi assolutamente gli unici strumenti in grado di approfondire lo studio e la comprensione delle cause delle patologie della specie animale “uomo”, definendo i presupposti scientifici per il progredire degli studi ai fini di cure risolutive.

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