Tavolo scientifico: aggiornamento per i metodi alternativi

Alla Riunione (Tavolo di Aggiornamento per i MA, Metodi Alternativi avanzati) del 28 dicembre 2015, presso la sezione di Patologia Generale del Dipartimento di Medicina Sperimentate Università di Genova si sono discussi diversi aspetti relativi alla sperimentazione alternativa in vitro condotta dal Laboratorio di Analisi e Ricerca in Fisiopatologia (LARF) certificato ISO9001:2008.
1. Risultati ottenuti nel progetto dal titolo “Cellule umane staminali adulte indotte al differenziamento neurogenico: un modello alternativo alla sperimentazione animale per lo studio della neurotossicità di composti chimici” finanziato dalla LEAL. Il progetto è basato sul differenziamento di cellule staminali adulte, di origine umana, chiamate ADSCs, provenienti da tessuto adiposo umano e differenziate verso cellule neuronali, allo scopo di allestire un modello alternativo in vitro per valutare i rischi dell’esposizione ad inquinanti ambientali, farmaci e xenobiotici sullo sviluppo neurologico umano. È indispensabile premettere una precisazione al fine di comprendere l’importanza della fase “a”. Il siero, che è la parte liquida, fluida, del sangue dei vertebrati derivato da altri animali (come il bue e il cavallo), era indispensabile per consentire alle cellule di crescere, cioè di riprodursi e diventare numerose. Inoltre, per staccare le cellule dal supporto in cui sono contenute (ad esempio, piastre o fiasche di coltura, sia in vetro che in plastica), si usava tripsina (è un enzima che “scioglie” i legami tra cellule e supporto) di origine suina, cioè proveniente da maiali. Quindi, anche se usavamo cellule umane eravamo costrette ad utilizzare materiale di origine animale. Se la questione etica è comunque critica (anche se gli animali erano da macello), la questione scientifica ci lasciava ancora più perplesse: creavamo in pratica delle “chimere”, ossia un costrutto che era una mescolanza di più animali insieme. Da un punto di vista scientifico è davvero un’eresia. È assolutamente necessario, data l’importanza anche di un solo aminoacido, di una piccolissima molecola nei processi biochimici, usare materiale specie-specifico. Per questo motivo, da diversi anni, abbiamo soppiantato l’uso della tripsina di maiale con un enzima sintetico derivato da ingegneria genetica batterica (efficace, comodo per l’uso, economico: una vera panacea, rimedio universale per risolvere problemi di “necessità distacco cellulare”!). Per la sostituzione del siero animale ci siamo attrezzate tempi più recenti, data la difficoltà sia tecnica sia economica, ma ci stiamo assiduamente lavorando.

a. Durante le prime fasi del progetto abbiamo testato l’efficacia proliferativa del lisato piastrinico (di origine umana, e anch’esso materiale di scarto dei centri trasfusionali) rispetto al siero fetale bovino sulle cellule staminali di grasso umano ADSCs, per poter poi avere un numero maggiore di cellule da indurre verso il fenotipo neuronale (obiettivo: farle “diventare” cellule nervose).
b. Le ADSCs, dopo amplificazione in presenza di lisato piastrinico, sono state indotte al differenziamento neurogenico, secondo un protocollo già standardizzato in laboratorio, con opportune variazioni, sulla base dei dati raccolti dalla letteratura scientifica più recente. Per l’induzione al differenziamento neurogenico, si è deciso di utilizzare 2 protocolli più recenti di quello utilizzato in precedenza dal nostro gruppo di ricerca, in modo tale da ottenere una procedura di differenziamento verso la linea neurogenica più efficiente: la ricerca è fatta di tentativi, e noi quindi cerchiamo sempre di “aggiustare il tiro”, cercando di perfezionare il metodo, stando attente alla letteratura scientifica internazionale. La fase di differenziamento delle ADSCs è molto delicata, dato che le cellule per differenziarsi devono adattarsi alle nuove condizioni di coltura, attivando e spegnendo geni bersaglio per riprogrammarsi verso il nuovo tipo cellulare maturo. Per questo motivo le prime colture primarie ottenute non hanno sopportato il trattamento di differenziamento. Si richiede, perciò, una quantità di tessuto adiposo di scarto nettamente superiore a quello ottenuto con la sola tecnica di lipofilling ed è per questo che si è richiesta un’estensione al comitato etico delle fonti di tessuto adiposo, necessario per proseguire il progetto. Infatti, i primi tentativi fatti finora non sono ancora soddisfacenti, per scarsezza di materiale. Quindi attualmente stiamo lavorando sul miglioramento del protocollo di espansione e di pre-differenziamento per dare alle cellule la giusta spinta verso l’attivazione dei geni opportuni per il differenziamento verso la linea neurogenica, così da poterle utilizzare come modello in vitro per la valutazione della neurotossicità umana di composti chimici.

2. Risultati ottenuti dai tentativi di adattamento delle colture cellulari umane stabilizzate del LARF (NCTC2544, cheratinociti indifferenziati; HECV, endoteliociti da vena ombelicale; HFFF2, fibroblasti fetali di prepuzio) a diversi sieri sintetici in modo tale da sostituire l’utilizzo del Siero Fetale Bovino (FBS) nei medium, necessari al mantenimento delle linee cellulari. Purtroppo le diverse prove non hanno dato i risultati sperati. I tempi di adattamento sono troppo lunghi da essere fattibili con la completa sostituzione, in rapporto con le attività sperimentali routinarie. Inoltre, le cellule tendono a modificare la loro normale morfologia, esprimendo molecole di superficie diverse da quelle presenti nelle linee cellulari mantenute in condizioni standard di coltura.
3. Risultati ottenuti mediante l’utilizzo, come sostituto del FBS, del Lisato piastrinico Lyset™. Questo prodotto è un supplemento di coltura cellulare completamente standardizzato e liofilizzato, sterile (gamma irradiato), contenente Fattori di Crescita (GF) coinvolti in vari processi cellulari di proliferazione, sintesi della matrice extracellulare, induzione dell’angiogenesi. La concentrazione piastrinica è definita, pari a 1 x 107/μL. Le piastrine derivano da “buffy coat” di pool di donatori umani sani. Il prodotto ha delle buone potenzialità perché aumenta la proliferazione cellulare, mantenendo il potenziale di differenziazione in cellule altrimenti difficili da espandere; permette la coltura di cellule in un ambiente privo di componenti animali; non c’è nessuna variabilità di lotto, con una disponibilità potenzialmente illimitata. Abbiamo quindi allestito diversi protocolli di adattamento delle diverse linee cellulari umane di utilizzo del LARF.

a. Sulle linee cellulari umane stabilizzate si sono riscontrati ancora una volta problemi di adattamento. Nuovi esperimenti verranno programmati al più presto, dopo aver verificato alcuni parametri. Tuttavia, visto i risultati poco soddisfacenti, in relazione con il costo elevato del prodotto, per ora i test sono stati sospesi, in attesa di fondi dedicati.
b. Sulle colture primarie di pre-adipociti, ADSCs, i primi risultati di adattamento sono risultati promettenti. Infatti, le cellule staminali adulte, isolate da tessuto adiposo tendono ad amplificarsi maggiormente. I test relativi alla proliferazione cellulare finora eseguiti sulle colture di ADSCs, ottenute da lipoaspirato, confermano le proprietà del lisato piastrinico come sostituto del FBS, nel sostenere l’amplificazione delle cellule staminali.

4. Discussione della volontà del LARF, con adeguati fondi, di programmare esperimenti di citofluorimetria ed opportune indagini genetiche, per dimostrare la staminalità delle colture primarie isolate da tessuto adiposo e monitorare il differenziamento, verso il fenotipo nervoso, dei pre-adipociti.
5. Allestimento di nuovi modelli alternativi in vitro che riproducano la barriera ematoencefalica, in modo tale da migliorare i test tossicologici a livello del tessuto nervoso, in collaborazione con IvTch, una ditta italiana che produce bioreattori microfluidici che consentono di simulare in 3D le interazioni tra gli organi.
6. Divulgazione delle nuove metodiche alternative in vitro, nel panorama scientifico internazionale, attraverso convegni e corsi di training.
7. Lo staff del LARF cerca di partecipare, compatibilmente con le risorse economiche a disposizione, a congressi internazionali focalizzati sullo studio della tossicità in vitro.
8. Infine, con il professore Bruno Fedi si è parlato del prossimo tavolo di lavoro sui Metodi Avanzati specie-specifici innovativi ed avanzati che si terrà a Roma e che vedrà la partecipazione, tra gli altri, della professoressa A.M. Bassi e della dottoressa C. Scanarotti, quali esperte di metodi alternativi in vitro.

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